Трансгенні тварини, приклади яких будуть наведені нижче, були отримані експериментальним шляхом. Вони містять у своїх клітинах додаткову ДНК-трансген, впроваджену в клітини тварини з хромосомами і там реализующуюся. Трансген успадковується, згідно із законами Менделя.

Причини створення

Трансгенні рослини і тварини розрізняються ступенем складності свого створення. Тварини використовуються для вирішення теоретичних завдань в біомедицині та сільському господарстві. Серед причин створення трансгенних організмів можна визначити наступні:

тварини з геном гормону росту в рівних умовах утримання видають підвищені темпи зростання;

для посилення імунітету до інфекцій;

для отримання біологічно активних речовин;

для отримання людського білка від трансгенних тварин;

використання тварин як біореакторів для отримання медпрепаратів.

Перші такі тварини були отримані в 1974 році в Кембриджі ученим на ім'я Рудольф Яніш. Він ембріон миші ввів ДНК-вірус мавпи. У Росії перші трансгенні тварини були виведені в 1982 році.

Отримання

Навіщо потрібні трансгенні тварини? Їх створення відбувається шляхом перенесення клонованих ДНК ядра запліднених яйцеклітин, званих зиготами, або стовбурових ембріональних клітин. Після чого в органи репродуктивності пересідають змінені зиготи або яйцеклітини. Якщо не вдаватися в подробиці, то весь процес полягає в наступному:

В ядро яйцеклітини, попередньо заплідненої, вводиться клонований ген.

Запліднені яйцеклітини з впровадженої ДНК поміщаються в обрану заздалегідь жіночу особину для подальшого виношування трансгенного плода.

Проводиться відбір потомства, народженого за допомогою впровадження чужорідної ДНК, з таким розрахунком, щоб клонований ген містився в кожній клітині отриманого організму.

Схрещуються тварини, які у клітинах зародкової лінії несуть клонований ген.

Таким чином отримують нову генетичну лінію.

Подібні експерименти дуже затратні в плані необхідного для цього часу. Незважаючи на це, трансгенез стає потужним інструментом для дослідження захворювань людини. За допомогою трансгенеза проводиться робота над генетичною модифікацією молочних залоз тварин для отримання із молока білка, ідентичного людському, а також для виготовлення фармацевтичних препаратів.

Методи трансгенеза тварин

Для чого вони потрібні? Трансгенні тварини – це окремі особини, геном яких відрізняється штучно доповненої генетичною інформацією. Трансген являє собою в одному випадку самостійний ділянку ДНК з власними регуляторними послідовностями. В іншому - це створений з різних молекул ДНК-гібридний (рекомбінантний) ген. Трансген – це введений штучно і закріпився в ДНК тварини чужорідний ген. А трансгенез – це процес інтеграції і перенесення в геном тварини чужорідної генетичної інформації. Існують певні методи отримання трансгенних тварин. Серед них виділяють:

Микроинъекционний метод.

Метод використання ретровірусних векторів.

Пересадка ядер клітин, що культивуються in vitro.

Метод ліпосом – переносників ДНК.

Метод використання статевих клітин сім'яників.

Метод мікроін'єкції

Вперше для отримання трансгенних тварин був використаний саме метод мікроін'єкції. Це сталося в 1985 році одночасно в двох дослідних лабораторіях. Одна з них належала США, інша перебувала в Німеччині. В даний час цей метод є найбільш часто використовуваним.
Спосіб мікроін'єкції заснований на введенні розчину генних конструкцій в чоловічий пронуклеус (попередник ядра) зигот. При заплідненні в яйцеклітині утворюються два ядра, одне з яких чоловіче (чоловічий пронуклеус), інше - жіноче (жіночий пронуклеус). Чоловічий і жіночий пронуклеуси після зближення об'єднуються в загальне ядро з з'єднанням батьківських і материнських хромосом в один генотип ембріона. Про успішність мікроін'єкції можна судити по збільшенню обсягу пронуклеусів у 15 рази. Коли процедура завершується, отримані ембріони кілька годин культивуються, а потім підсаджуються в матку одночасно кільком самкам. Після народження потомства проводиться аналіз на інтеграцію трансгену шляхом відбору проб. Кількість трансгенних малюків від загального числа народженого за допомогою даного методу потомства досить незначно. У піддослідних мишей це приблизно 15 %, у свиней - від 10 до 15 %, у овець, кіз і великої рогатої худоби цей показник лавируется від 5 до 10 %. Над поліпшенням даного співвідношення вчені працюють донині.

Метод використання ретровірусних векторів

Перенесення ДНК в ембріональні лінії тварин за допомогою ретровірусних векторів – це досить результативний метод. Ретровіруси є ядросодержащими вірусами. Їх генетичний матеріал – це одноланцюжкова рибонуклеїнова кислота (РНК). Ретровіруси можуть бути экотропними, тобто здатними відтворюватися в клітинах одного виду тварин або кількох близькоспоріднених видів. Наприклад, вірус лейкимии миші може розмножуватися тільки в клітинах миші або щури. Амфотропние ж віруси здатні до поширення в багатьох видах тварин.
Ретровірус проникає в клітину за допомогою микропиноцитоза – транспорту невеликих за розміром молекул. У одних вірусів транскрипція відбувається в ядрі клітини, в інших - в цитоплазмі. Якщо інтеграція трапляється в геномі генеративних клітин, то ретровіруси передаються нащадкам у спадок. Тут йде мова про ендогенних ретровірусів. Вперше вірусна ДНК була виявлена в клітинах дорослої миші в 1974 році. Інфекція зигот у більшості випадків призводить до отримання трансгенних тварин, так як інтеграція можлива, якщо клітина набуває непряме розподіл після реплікації ДНК. Переваги використання ретровірусних векторів:

Майже 100 % ембріонів, оброблених ретровірусом, можуть бути інфіковані.

Стає можливим проведення генної терапії спадкових захворювань.

Ретровіруси роблять можливою трансформацію окремих органів (наприклад, молочних залоз для підвищення удою).

Недоліки використання ретровірусних векторів:

Обмежена ємність.

Придушення експресії трансгенів in vivo.

Низький титр (вирішена за допомогою псевдотипирования).

Можливість клітинних онкогенів.

Неможливість передачі у спадок трансформації окремих органів.

Метод пересадки ядер клітин

Особливістю методу є використання трансформованих клітинних ліній для отримання трансгенних особин за допомогою генних конструкцій. Для цього беруться стволові лінії, а також соматичні клітини, які культивуються in vitro, тобто в пробірці. Одним з методів пересадки ядер є метод мікроманіпуляції, і полягає він у наступному:

За допомогою мікропіпетки відбувається вилучення пронуклеусов після того, як відбулося проколювання зон пеллюцида та зон плазматичної мембрани.

Піпеткою з великим діаметром в той же прокол вводиться ядро з повним набором хромосом від донора.

За допомогою такого методу цитоплазма зиготи травмується набагато менше, як і донорське ядро. Існує ще один спосіб трансплантації ядра. Цей метод полягає у використанні для цієї мети цитохалазинов, тобто речовин, які синтезовані за допомогою грибів. Структура микроферментов (ниток, що складаються з молекул глобулярного білка актину) руйнується цитохалазином, після чого ядро може бути розташоване унікальним чином. Ядро за допомогою тоненької нитки цитоплазми залишається з'єднаним з кліткою. Потім ця зв'язок штучно розривається за допомогою центрифугування. Утворюються цитопласти (клітини без ядра) і кариопласти (ядра, оточені цитоплазмою). В градієнті щільності цитопласти відокремлюються від інтактних клітин, і можуть бути використані для з'єднання з кариопластами інших клітин, щоб вийшла життєздатна клітина.

Метод ліпосом – переносників ДНК

Це самий нешкідливий метод трансгенеза. Його особливість полягає у використанні ліпосом для збереження і перенесення в них генів. Ліпосоми створюються з різними властивостями. Вони не иммуногени і не володіють токсичністю. Проте даний метод не є ефективним, тому що ДНК, транспортированная таким чином в клітку, відразу ж захоплюється лизосомами і руйнується ними.

Метод використання статевих клітин сім'яників

Сперматозоїди – це природний вектор, який транспортує ДНК у клітину. Але що проводяться в цій області дослідження показали неоднозначні результати методу. В експериментах М. Lavitrano в 1989 році 30 % досвідчених мишей, які були отримані за допомогою ін'єкцій змінених сперматозоїдів в незапліднені яйцеклітини миші, виявилися трансгенними і могли передавати трансген у спадок. В іншому випадку безліч спроб повторити цей результат в інших лабораторіях не увінчалися успіхом, при подібних умовах були отримані різні результати. З усього цього можна зробити припущення, що вдала трансформація ДНК спостерігається лише на певній стадії клітинного циклу. До цих пір ведуться дослідження в області визначення механізму вбудовування екзогенної ДНК в геном сперматозоїда. Можливість використання після кріоконсервації сперми є позитивним моментом цього методу. Негативною ж стороною вважається велика кількість мікроманіпуляцій, необхідних при трансгенезе за допомогою цього способу. Але все ж сперматозоїди мають здатність поглинати ДНК і накопичувати її в ядрі. Для досягнення більшого ефекту сполуки ДНК зі сперматозоїдом існує кілька методів: ліпосомний, ін'єкція в насінники, в насінні канальці за допомогою створення пір в ліпідній мембрані під дією електричного поля.

Вимкнені гени

Виключення гена – це придушення експресії генів, тобто сайленсинг генів або генний нокаут. При цьому процесі експресія необхідного гена припиняється, але послідовність нуклеотидів залишається незмінною. Виключення гена може відбуватися при перенесенні інформації з ДНК на РНК, тобто транскрипції, і після неї. Механізми вимикання генів захищають організм від вірусів і стрибаючих генів. Тому сайленсинг є частиною імунної системи, яка захищає від чужорідної ДНК. Трансгенні тварини з вимкненими генами і їх створення називаються генним націлених.

Успадкування генів, згідно із законами Менделя

Закони Менделя описують особливості передачі організму від батька до організму дитинча характеристик, несучих спадковість. Ці принципи знаходяться в основі класичної генетики. В основному у всіх наукових статтях розкривається одне з правил Менделя і пара законів. Правило першого покоління гібридів і їх однаковість свідчить про те, що дані гібриди завжди успадковують один з ознак батька. Закон розщеплення ознак є першим законом Менделя. У ньому йдеться про те, що у 3/4 піддослідних тварин виявлено домінантні ознаки, а в 1/4 - рецесивні. Закон незалежного успадкування ознак є другим законом. Тут Менделем описується розподіл ознак при схрещуванні полигибридном та дигібридному.

Корисні властивості

Створення трансгенних тварин з новими корисними властивостями – це процес безперервний. Трансгенні тварини, приклади яких наведено нижче, вже існують в сучасному світі:

У Великобританії за допомогою трансгенеза були виведені вівці. Молоко цих тварин містить у собі фактор, що сприяє згортанню крові.

У трансгенних свиней, створених в Росії, був змінений обмін речовин допомогою введення гена соматотропіну, що дозволило знизити жирність м'яса.

Американці працюють над створенням корів, в чиєму молоці міститься людський альбумін, який використовується для підтримки нормального тиску крові.

Перспективи використання трансгенних тварин

У найближчому майбутньому передбачається створення таких тварин, одні гени яких побиті, а інші введені до складу їх геному.

Отримання модифікованого молока.

Передбачається, що таке молоко в своєму складі буде максимально наближене до складу материнського молока людини. В цьому напрямку проводиться робота з ембріональними стовбуровими клітинами.

Використання трансгенних тварин для отримання органів, які пересідають людині.

Не секрет, що людство має потребу в донорських органах. Зараз генетики ведуть роботу над вирощуванням таких органів у тілі тварин. Наприклад, органи свиней цілком могли б підійти по своєму розміру і складу. Але вони будуть негайно відторгнуті людської імунною системою. Щоб цього не відбувалося, створюється трансгенна свиня, у якій вимкнені гени гістосумісності, а замість них впроваджені гени гістосумісності людини.

Клонування трансгенних тварин.

Створення трансгенних тварин - трудомісткий процес. Згідно зі статистикою, на 100 инъецированних зигот вівці, 40 мишачих зигот і 1500 зигот корів припадає менше 50% особин, які експресують трансгенний білок. При вдалій спробі отримання трансгенного тварини зовсім необов'язково, що його нащадками буде наслідуватися трансген. Тому клонування тварини з необхідними генетичними параметрами – є оптимальний вихід з положення.