Перш ніж досліджувати під мікроскопом мікроорганізми, досліджуваний зразок піддають спеціальній підготовці. У природному вигляді практично всі бактерії прозорі, тому їх фарбують барвниками. Фарбування дозволяє визначити як морфологічні властивості досліджуваних мікробів, так і належність їх до того чи іншого виду. Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називається тинкториальними властивостями. З їх допомогою біологи визначають вид мікроба, його параметри, особливості структур, а також виявляють збудників інфекційних захворювань. З цієї статті ви детальніше дізнаєтеся, що це – тинкториальние властивості, а також як їх використовують у науці.

Завдання, які вирішує метод фарбування

Насамперед давайте з'ясуємо, у чому значення тинкториальних властивостей мікроорганізмів. Фарбування зразка є однією з ключових технік мікробіології, дозволяють вивчити як зовнішнє, так і внутрішнє будова організмів. Бактерії є напівпрозорими мікроорганізмами, заломлюючими промені світла. Тому при звичайному мікроскопірованіі їх не можна розглянути. Різні частини бактерії по-різному взаємодіють з барвником. Тинкториальние властивості – це чудова можливість для дослідників. Будучи різними у різних мікроорганізмів, вони дозволяють визначити їх найважливіші характеристики: форму, розмір, будову, локалізацію та інше.

Підготовка зразка і його забарвлення

Незалежно від того, яку методику фарбування практикує дослідник, дана процедура складається з низки обов'язкових стадій:

Приготування зразка. В краплю води, розміщену на предметному склі, за допомогою бактеріологічної петлі вносять досліджуваний матеріал.

Сушка мазка. Проводиться при кімнатній температурі або в потоці теплого повітря (але не занадто близько до джерела тепла).

Фіксація. Передбачає закріплення мікроорганізмів на склі, з метою посилення їх сприйнятливості до фарбування.

Фарбування. На досліджуваний зразок наносять барвник і дають йому якийсь час постояти. Потім залишки барвника видаляють і промивають зразок водою.

Сушіння. Заключна стадія, дозволяє позбутися від залишків води після промивання. Після сушіння зразок готовий до вивчення під мікроскопом.

Поширені барвники

Фарбування зразків проводять за допомогою анілінових барвників, з різним показником кислотності (рН). Їх поділяють на: основні (наголос на другу букву о), кислотні та нейтральні.


В основних барвниках діючим агентом виступає катіон. З допомогою різних реагентів можна отримати різні кольори фарбування мікробів:

Червоний – пиронин, сафранін, нейтральрот, фуксин основний.

Фіолетовий – тионин, метил-, генциан - і кристаллвиолет.

Синій – метиленова синь і вікторія.

Зелений – малахітова і метиленова зелень.

Чорний – индулин.

Коричневий – везувин і хризоидин.

В кислотних барвниках фарбувальними властивостями наділена аніон. З них найбільш поширені:

Червоний – кислий фуксин і еозин.

Чорний – нігрозин.

Жовтий – пикроновая кислота.

Нейтральні барвники можуть забарвлювати як аніони, так і катіони. В якості яскравого прикладу можна назвати родамін Ст.
Існуючі методи фарбування, засновані на тинкториальних властивості мікроорганізмів, можна розділити на три головних типи: вітальний, поствитальний та фарбування спір. На кожному з цих методів зупинимося докладніше.

Вітальний спосіб

Даний метод також називається прижиттєвим, отже, фарбування проводиться з метою мікроскопування живих організмів. Введення фарбувального препарату дозволяє дослідити особливості внутрішньоклітинних структур і тканин. Є також методики вітального фарбування, передбачають умертвіння зразка відразу після фарбування. Для прижиттєвого фарбування використовують спеціальні барвники, відрізняються низькою токсичністю та високою проникаючою здатністю. Крім вітальних препаратів, для вирішення цієї задачі застосовують також флуорохроми або флуоресцентні барвники.

Поствитальний спосіб

На відміну від попереднього варіанту, тут фарбування роблять після умертвіння мікроорганізмів. Методи поствитального фарбування поділяють на прості і складні. Прості дозволяють визначити морфологічні властивості досліджуваних організмів: форму, розмір, локалізацію, взаєморозташування. Складні ж методи є вузькоспрямованими і дозволяють отримати відомості про структуру мікроорганізму. Найчастіше складні способи фарбування носять імена своїх творців. З них найбільшою популярністю користуються наступні методики. Метод Грама. Спосіб, розроблений ще в кінці 19 століття, базується на диференціації мікробів по проникності клітинних стінок. З допомогою обробки зразка аніліновими барвниками (генціановий фіолетовий або метиловим) і наступної промивки дослідник отримує два типи мікробів: грампозитивні (характерна синє забарвлення) і грамнегативні (забезпечені). Для того щоб отримати більш повну картину, використовується також червоний барвник, після обробки яких навіть грамнегативні мікроорганізми набувають забарвлення – від рожевого до червоного.
Методика Грама дозволяє класифікувати мікроби і провести їх поділ за тінкториальними властивостями. Це один з найбільш простих і розповсюджених методів підготовки зразка для мікроскопування. Прикладне значення даної методики полягає в діагностиці різних інфекційних захворювань. Метод Ціля-Нільсена . Цей спосіб був розроблений також в кінці XIX століття. Він ґрунтується на визначенні кислотоустойчивости бактерій за допомогою фарбування. Цим методом, завдяки тинкториальними властивостями мікроорганізмів, можна виявити збудники туберкульозу, лепри і мікобактеріозу. Методика Романовського-Гімзе . Цей спосіб був розроблений вже на початку двадцятого століття. Його суть полягає в тому, що після фарбування зразка спеціальним барвником ацидофільні бактерії набувають різні відтінки червоного кольору, а базофільні – від пурпурного до синього. Ацидофилами називають молочно - і оцтовокислі бактерії, для життєдіяльності яких необхідна низька кислотність середовища. Базофіли ж являють собою мікробів, які можуть бути пофарбовані основними барвниками. Таким чином, метод базується на поділі мікробів за значенням кислотності середовища. Його широко застосовують у вивченні морфології найпростіших і спірохет. Методика Буррі-Гінса . Дозволяє визначити наявність у бактерій капсул. Метод Морозова. Даний спосіб забарвлення дає можливість зробити джгутики бактерій видимими. Для цього необхідно здійснити такі маніпуляції:

Обробити зразок кислотою, щоб джгутики разрихлились.

Зафіксувати розпушений тканини таніном.

Пофарбувати зразок азотнокислим сріблом.

В результаті бактерія, з усіма своїми джгутиками, стає видимою. Її колір може коливатися від жовтого до коричневого.

Фарбування спір

Тинкториальние властивості мікроорганізмів дозволяють з допомогою забарвлення зробити помітними їх спори. Для цього найчастіше використовують методику Циля-Нільсона. Її суть полягає в обробці досліджуваного зразка фуксином Ціля і його подальшому знебарвленні з допомогою одновідсоткової сірчаної кислоти. В результаті суперечки забарвлюються в рожевий колір і добре виділяються на тлі синьої бактерії. Отримати видиму картину спір дозволяє також методика Ожешко. Згідно з цим методом, оболонки спір спочатку обробляють при високій температурі кислотою, а потім використовують для фарбування по Цилю-Нильсону.

Структурні особливості мікробів

Клітка мікроорганізму зазвичай складається їх стінок (оболонка), цитоплазматичної мембрани, цитоплазми, містить у своєму складі нуклеотид і включення. Деякі різновиди мікробів також мають джгутиками, фимбриями або віями, і можуть утворювати капсули або суперечки. Оболонка мікроорганізму обумовлює його форму, а також захищає його від несприятливого навколишнього середовища і осмотичного внутрішнього тиску. Стінки мікробів мають досить складні хімічний склад і структуру. У грампозитивних і грамнегативних клітин вони відрізняються. Перші мають товсту клітинну стінку, яка містить тейхоевие кислоти і трохи ліпідів. Стінка друге складається поліпептидного і полісахаридного шарів. Зовні клітинна стінка покрита слизовим шаром. У деяких мікробів він може збільшуватися (набухати) утворюють капсулу, яка складається переважно з полісахаридів, а іноді, поліпептидів. Вона маловосприимчива до фарбування. Саме тому такі мікроби вивчають за допомогою методу Буррі-Гінса. У деяких патогенних мікробів (наприклад, пневмокока) капсула утворюється тільки в організмах тварин або людини. При дослідженні мікробів під мікроскопом увага звертається на забарвлювання цитоплазми та її структур. Цитоплазма може забарвлюватися гомогенно (однорідне) або гетерогенно (присутні включення органічної або неорганічної природи). Для вивчення включень використовують спеціальні методики фарбування (наприклад, по Нейссеру). Крім того, у складі цитоплазми визначають наявність ядра або нуклеотиду. Дізнавшись, що це – тинкториальние властивості і те, як вони допомагають у мікроскопірованіі, розглянемо особливості деяких поширених мікробів.

Стрептококи

З точки зору тинкториальних властивостей стрептококи є грампозитивними мікроорганізмами, тому їх визначають за методом Грама. Найбільш яскраве забарвлення цих бактерій відбувається при впливі синькою Лаффера. Структура розташування їх клітин нагадує ланцюжок.

Сальмонели

Являють собою факультативні анаероби, більшість з яких рухомо завдяки наявності джгутиків. На щільному живильному середовищі сальмонели збираються круглі біло-сірі колонії. Суперечка не утворюють, мають перитрихи і мікрокапсулу. Як і стрептококи, сальмонели забарвлюються за методом Грама. Різниця полягає в тому, що за своїм тінкториальними властивостями сальмонели грамотрицательни.

Менінгококи

Мають округлену поліморфну форму. На живильному середовищі розташовуються попарно. Тинкториальние властивості менінгококів такі, що вони грамотрицательни, однак на забарвлення за Грамом реагують недостатньо чітко. Нерівномірне фарбування обумовлюється тим, що чим старіше клітина, тим слабший її тинкториальние властивості. Джгутиків менінгококи не мають, а суперечка не утворюють.

Холерний вібріон

Даний мікроб має один полярний джгутик, який забезпечений чохликом і ундулирующей мембраною. Холерний вібріон має виражену рухливість. Для нього характерний поліморфізм. Тинкториальние властивості холерного вібріона обумовлюють його забарвлення аніліновими фарбниками. Як правило, це водний фуксин Пфейфера або карболовий фуксин Шля.

Кишкова паличка

Являє собою факультативний анаероб, не утворює спор. Клітини мають форму паличок із закругленими кінцями. Тинкториальние властивості кишкової палички відносять її до грамнегативних бактерій. Штами бактерій з перитрихально розташованими джгутиками можуть пересуватися.

Нейтрофіли

Таку назву мікроби отримали завдяки своїм тінкториальними властивостями. Нейтрофіли можуть інтенсивно забарвлюватися за методом Романовського, як основними барвниками, так і кислотним еозином. Дорослі бактерії мають сегментоване ядро, а отже, ставляться до полиморфонуклеарам. Вони наділені адгезивність, рухливістю, а також здатність до хемотаксису і захоплення частинок. Разом з базофілами та еозинофілами відносяться до гранулоцитів.

Базофіли

За аналогією з попередніми мікробами, ці бактерії отримали свою назву завдяки тінкториальними властивостями. Базофіли інтенсивно забарвлюються основним барвником і зовсім не забарвлюються кислим еозином. Вони мають великі гранулоцити і містять багато: гістаміну, серотоніну, простагландинів, лейкотрієнів та інших медіаторів запальних та алергічних процесів.

Еозинофіли

На відміну від двох попередніх гранулоцитів, ці мікроби інтенсивно забарвлюються тільки кислим барвником, і зовсім не забарвлюються основними препаратами. Еозинофіли наділені здатністю до екстравазації, хемотаксису і амебоидному руху. Вони можуть поглинати і зв'язувати ряд медіаторів запальних та алергічних реакцій.