Львів
C
» » Іммобілізовані ферменти та їх застосування

Іммобілізовані ферменти та їх застосування

Вперше поняття про іммобілізованих ферментів виникло у другій половині 20-го століття. Між тим, ще в 1916 р. було встановлено, що сорбированная на вугіллі сахароза зберігала каталітичну активність. У 1953 р. Д. Шлейт і Н. Грубхофер здійснили перші зв'язування пепсину, амілази, карбоксипептидази і Рнкази з нерозчинним носієм. Поняття іммобілізованих ферментів було узаконено в 1971 р. Це сталося на першій конференції з питань інженерної ензимології. У теперішній же час поняття про іммобілізованих ферментів розглядається в більш широкому сенсі, ніж це було в кінці 20 століття. Розглянемо цю категорію докладніше.
Іммобілізовані ферменти та їх застосування



Загальні відомості

І ммобилизованние ферменти – сполуки, які штучно пов'язуються з нерозчинним носієм. При цьому вони зберігають свої каталітичні властивості. В даний час цей процес розглядається в двох аспектах – в рамках часткової і повної обмеженості свободи переміщення білкових молекул.

Переваги

Вчені встановили певні переваги іммобілізованих ферментів . Виступаючи в якості гетерогенних каталізаторів, вони можуть з легкістю відділятися від реакційної середовища. В рамках досліджень встановлено, що застосування іммобілізованих ферментів може бути багаторазовим. В процесі зв'язування сполуки змінюють свої властивості. Вони набувають субстратную специфічність, стійкість. При цьому їх активність починає залежати від умов середовища. Іммобілізовані ферменти відрізняються довговічністю і високою ступенем стабільності. Вона більше, ніж, наприклад, у вільних ензимів в тисячі, десятки тисяч разів. Все це забезпечує високу ефективність, конкурентоспроможність та економічність технологій, в яких присутні іммобілізовані ферменти.


Носії

Дж. Порату визначив ключові властивості ідеальних матеріалів, які повинні використовуватися при іммобілізації. Носії повинні володіти:
  • Нерастворимостью.
  • Високою біологічною і хімічною стійкістю.
  • Здатністю до швидкої активації. Носії повинні легко переходити в реакційно-здатний вигляд.
  • Значною гидрофильностью.
  • Необхідною проникністю. Її показник повинен бути однаково прийнятний і для ферментів, і для коферментів, продуктів реакції і субстратів.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування
  • В даний час не існує матеріалу, який би повністю відповідав цим вимогам. Тим не менше на практиці застосовуються носії, які придатні до іммобілізації певної категорії ферментів в конкретних умовах.

    Класифікація

    В залежності від своєї природи матеріали, при зв'язку з якими сполуки перетворюються в іммобілізовані ферменти , поділяються на неорганічні і органічні. Зв'язування багатьох сполук здійснюється з полімерними носіями. Ці органічні матеріали поділяють на 2 класи: синтетичні і природні. У кожному з них, у свою чергу, виділяють групи в залежності від будови. Неорганічні носії представлені переважно матеріалами зі скла, кераміки, глини, силікагелю, графітової сажі. При роботі з матеріалами популярні методи сухої хімії. Іммобілізовані ферменти отримують шляхом покриття плівкою носіїв оксидів титану, алюмінію, цирконію, гафнію або обробки органічними полімерами. Важливим достоїнством матеріалів є легкість регенерації.

    Білкові носії

    Найбільшою популярністю користуються ліпідні, полісахаридні і білкові матеріали. Серед останніх варто виділити структурні полімери. До них в першу чергу відносять колаген, фібрин, кератин, а також желатин. Такі білки досить широко поширені в природному середовищі. Вони доступні й економічні. Крім цього, вони володіють великою кількістю функціональних груп для зв'язування. Білки відрізняються здатністю до біодеградації. Це дозволяє розширити застосування іммобілізованих ферментів у медицині . Між тим, є у білків і негативні властивості. Недоліки використання іммобілізованих ферментів на протеїнових носіях полягають у високою імуногенності останніх, а також можливість впроваджувати в реакції лише певні їх групи.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування

    Полісахариди, аминосахариди

    З цих матеріалів найчастіше застосовуються хітин, декстран, целюлоза, агароза і їх похідні. Щоб полісахариди були більш стійкі до реакцій, їх лінійні ланцюга зшивають поперечно епихлоргидрином. У сітчасті структури досить вільно вводяться різні іоногенні угруповання. Хітин у великих кількостях накопичується у вигляді відходів при промисловій переробці креветок і крабів. Це речовина відрізняється хімічною стійкістю і володіє добре вираженою пористою структурою.

    Синтетичні полімери

    Ця група матеріалів відрізняється великою різноманітністю та доступністю. У неї включені полімери на основі акрилової кислоти, стиролу, полівінілового спирту, поліуретанові та поліамідні полімери. Більшість з них відрізняються механічною міцністю. В процесі перетворення вони забезпечують можливість варіювання розміру пір в досить широких межах, введення різноманітних функціональних груп.

    Способи зв'язування

    В даний час існує два принципово відмінних один від одного варіанту іммобілізації. Першим є отримання сполук без ковалентних зв'язків з носієм. Цей спосіб є фізичним. Інший варіант передбачає виникнення ковалентного зв'язку з матеріалом. Це хімічний метод.

    Адсорбція

    З допомогою неї іммобілізовані ферменти отримують шляхом утримання препарату на поверхні носія завдяки дисперсійним, гідрофобним, електростатичних і водневих взаємодій зв'язків. Адсорбція стала першим способом обмеження рухливості елементів. Однак і в даний час цей варіант не втратив своєї актуальності. Більш того, адсорбція вважається найбільш поширеним способом іммобілізації в промисловості.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування

    Особливості способу

    У наукових виданнях описано понад 70 ферментів, одержаних адсорбційним методом. В якості носіїв виступали, переважно, пористе скло, різноманітні глини, полісахариди, оксиди алюмінію, синтетичні полімери, титан і інші метали. При цьому останні використовуються найчастіше. Результативність адсорбції препарату на носії визначається за пористості матеріалу та питомої поверхні.

    Механізм дії

    Адсорбція ферментів на нерозчинних матеріалах відрізняється простотою. Вона досягається при контакті водного розчину препарату з носієм. Він може проходити статичним або динамічним способом. Розчин ферменту перемішується зі свіжим осадом, приміром, гідроксиду титану. Потім в м'яких умовах з'єднання висушується. Активність ферменту при такій іммобілізації зберігається майже на все 100%. При цьому питома концентрація досягає 64 мг на грам носія.

    Негативні моменти

    До недоліків адсорбції відносять невисоку міцність зв'язування ферменту та носія. В процесі змін умов реакції можуть відзначатися втрата елементів, забруднення продуктів, десорбція білка. Для підвищення міцності зв'язування носії попередньо модифікують. Зокрема, матеріали обробляють іонами металів, полімерами, гідрофобними сполуками та іншими поліфункціональними агентами. У ряді випадків модифікації піддають сам препарат. Але досить часто це призводить до зменшення його активності.

    Включення в гель

    Цей варіант досить поширений завдяки своїй унікальності і простоті. Цей спосіб підходить не тільки для індивідуальних елементів, але і для мультиензимних комплексів. Включення в гель може виконуватись двома методами. У першому випадку препарат з'єднують з водним розчином мономеру, після чого виконують полімеризацію. В результаті виникає просторова структура гелю, що містить у клітинках молекули ферменту. У другому випадку препарат вноситься в розчин готового полімеру. Потім його переводять в стан гелю.

    Впровадження у напівпрозорі структури

    Суть даного методу іммобілізації складається у відділенні водного ферментного розчину від субстрату. Для цього використовується напівпроникна мембрана. Вона пропускає низькомолекулярні елементи кофакторів і субстратів і затримує великі молекули ферментів.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування

    Мікрокапсулювання

    Існує кілька варіантів впровадження в напівпрозорі структури. Найбільший інтерес з них представляє мікрокапсулювання і включення білків в ліпосоми. Перший варіант був запропонований у 1964 р. Т. Чангом. Він полягає в тому, що ферментний розчин впроваджується в замкнуту капсулу, стінки якої виконані з полупроницаемого полімеру. Виникнення мембрани на поверхні обумовлюється реакцією міжфазної поліконденсації сполук. Одне з них розчинено в органічній, а інше – у водній фазі. В якості прикладу можна назвати освіта мікрокапсули, одержуваної поліконденсацією галогенангидрида себаціновой до-ти (органічна фаза) і гексаметилендиамина-16 (відповідно, водна фаза). Товщина мембрани обчислюється в сотих частках мікрометра. При цьому величина капсул – сотні або десятки мікрометрів.

    Включення в ліпосоми

    Цей метод іммобілізації близький до микрокапсулированию. Ліпосоми представлені в ламелярних або сферичних ліпідних системах бислоев. Цей спосіб вперше був застосований у 1970 р. Для виділення ліпосом з ліпідного розчину проводять випарювання органічного розчинника. Залишилася тонка плівка диспергується у водному розчині, в якому присутній фермент. У ході цього процесу відбувається самозбірка ліпідних бислойних структур. Досить популярні такі іммобілізовані ферменти в медицині . Це обумовлюється тим, що більша частина молекул локалізується в ліпідному матриксі біологічних мембран. Включені в ліпосоми іммобілізовані ферменти в медицині є найважливішим дослідним матеріалом, що дозволяє вивчати і описувати закономірності процесів життєдіяльності.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування

    Утворення нових зв'язків

    Іммобілізація шляхом формування нових ковалентних ланцюгів між ферментами і носіями вважається найбільш масовим методом отримання біокаталізаторів промислового призначення. На відміну від фізичних способів цей варіант забезпечує необоротну і міцний зв'язок молекули і матеріалу. Її освіту часто супроводжується стабілізацією препарату. Разом з тим розташування ферменту на відстані 1-й ковалентного зв'язку щодо носія створює певні складнощі у виконанні каталітичного процесу. Молекулу відокремлюють від матеріалу за допомогою вставки. В якості неї часто виступають полі - та біфункціональні агенти. Ними, зокрема, є гідразин, бромциан, глутаровий диальгедрид, сульфурилхлорид та ін. наприклад, для виведення галактозилтрансферази між носієм і ферментом вставляють наступну послідовність —СН 2 —NH—(СН 2 ) 5 —ЗІ—. У такій ситуації у структурі присутня вставка, молекула і носій. Всі вони з'єднуються ковалентними зв'язками. Принципове значення має необхідність впровадження в реакції функціональних груп, не істотних для каталітичної функції елемента. Так, як правило, глікопротеїни приєднуються до носія не через білкову, а через вуглеводну частину. В результаті отримують більш стійкі і активні іммобілізовані ферменти.

    Клітини

    Описані вище способи вважаються універсальними для всіх типів біокаталізаторів. До них, зокрема, відносять клітини, субклеточние структури, іммобілізація яких набуває останнім часом широке поширення. Це обумовлюється наступним. При іммобілізації клітин відпадає необхідність виділяти і очищати ферментні препарати, впроваджувати в реакції кофактори. В результаті з'являється можливість отримувати системи, які здійснюють багатостадійні безперервно протікають процеси.
    Іммобілізовані ферменти та їх застосування

    Застосування іммобілізованих ферментів

    У ветеринарії , промисловості, інших господарських галузях досить популярні препарати, отримані зазначеними вище способами. Вироблені на практиці підходи забезпечують рішення проблем по здійсненню спрямованої доставки ліків в організмі. Іммобілізовані ферменти дозволили отримати медикаменти пролонгованої дії з мінімальною алергенність та токсичністю. В даний час учені вирішують проблеми, пов'язані з биоконверсией маси і енергії, використовуючи мікробіологічні підходи. Між тим, істотний внесок у роботу вносить і технологія іммобілізованих ферментів. Перспективи розвитку представляються вченими досить широкими. Так, в майбутньому одна з ключових ролей у процесі контролю над станом навколишнього середовища повинна належати нових видів аналізу. Зокрема, мова про біолюмінесцентному високоспецифічному і иммуноферментном методи. Особливе значення мають передові підходи до переробки лігноцеллюлозного сировини. Можна використовувати іммобілізовані ферменти в якості підсилювачів слабких сигналів. Активний центр може перебувати під впливом носія, що знаходиться під ультразвуком, механічними навантаженнями або схильного до фітохімічним перетворень.