Мікроорганізми в навколишньому нас природі знаходяться повсюдно: у грунтах, водоймах, на поверхнях всіляких предметів, ними населені люди і тварини. Все це може служити джерелами забруднення мікробами продуктів харчування, ліків, виробничих ліній. Культивування бактерій необхідно для вивчення їх властивостей, потреб, особливостей. Це в свою чергу є важливим етапом у розробці різних лікарських препаратів, лабораторної діагностики захворювань, розрахунку виробничих реакторів і багато чого іншого.
Загальні поняття
Під культивуванням бактерій в мікробіології розуміють вирощування мікроорганізмів, яке здійснюється в лабораторних умовах. У свою чергу мікроби, що виросли на підібраною живильному середовищі, називають культурою. Культури можуть бути змішаними, якщо вони утворені різними видами мікроорганізмів, та чистими, якщо представлені лише одним видом бактерій.
Якщо в живильне середовище поміщають тільки одну клітинку, а отримують в результаті її розмноження групу особин, то цю сукупність мікроорганізмів називають клоном. Коли клон розвивається до такого рівня, що стає видно неозброєним оком, таке скупчення бактерій називають колонією. Зазвичай культивування бактерій, виділених з різних джерел, роблять окремо один від одного. Кожну таку окремо вирощену групу мікробів називають штамом. Так, якщо один вид стафиллококка виділений з трьох джерел (або різних порцій одного і того ж продукту, різних осіб), говорять про три штами цього виду стафілокока.
Чинники зростання бактерій
До них відносять різні амінокислоти, ліпіди, пуринові підстави та інші сполуки, необхідні для розвитку мікроорганізмів. Деякі мікроби можуть самостійно виробляти необхідні їм речовини, а іншим необхідно отримувати їх у готовому вигляді. За потреби мікроорганізмів в тих чи інших ростових факторів проводять ідентифікацію та диференціацію бактерій. Також цей параметр важливий для правильного виготовлення поживного середовища в цілях проведення лабораторних і біотехнологічних робіт:
Амінокислоти. Бактерії можуть мати потребу в одній конкретній амінокислоти або якої-небудь групи кислот. Так, клостридиям необхідний лейцин і тирозин, стрептококів - лейцин і аргінін. Мікроорганізми, яким для зростання необхідно отримання амінокислот ззовні, називають ауксотрофными. Пуринові і пиримидиновые підстави, а також їх похідні (аденін, гуанін та інші). Вони є важливим чинником зростання багатьох видів стрептококів. Вітаміни. Вони входять до складу коферментів, необхідних бактеріям. Так, нікотинова кислота, а також її амід, що входять до складу НАД і НАДФ, потрібна коринебактериям дифтерії, шигели. Тіамін, як складова частина пірофосфату, потрібно золотистого стафілококу, пневмокока, бруцеллам. Пантотенова кислота, що входить в кофермент КоА, потрібно бациллам правця та окремих видів стрептокока. Цитохромы, а значить, утворюють їх фолієва кислота, геми і біотин, необхідні мікобактерій туберкульозу і гемофильным бактеріям. Вимоги до середовищ
Умови, які висуваються до живильних середовищ для культивування бактерій:
Поживність. Вони повинні містити речовини, причому знаходяться в легко усвояемом вигляді, необхідні для живлення мікроорганізмів і поповнення енергії. До них відносять органогени і мінеральні речовини. Для деяких мікроорганізмів додатково необхідні вітаміни і амінокислоти, які вони не можуть синтезувати. Оптимальний рівень рН. Він впливає на проникність клітинної оболонки і, відповідно, на можливість засвоєння поживних речовин бактерією. Найчастіше значення водневого показника повинно бути на рівні 72–74. Багато мікроорганізми в ході своєї життєдіяльності виробляють продукти з кислої або лужної реакції, і для того, щоб рН живильного середовища не змінювався, вона повинна мати буферність. Изотоничность. Осмотичний тиск в поживному середовищі для культивування бактерій повинно мати ті ж значення, що і всередині мікробних клітин. Зазвичай воно відповідає 05 % розчину NaCl. Стерильність. Пов'язано це з тим, що поява сторонніх бактерій спотворить результати вивчення аналізованого штаму. Рівень вологості. Цей показник поряд з консистенцією середовища повинен мати оптимальні характеристики для конкретного виду бактерій. Окисно-відновний потенціал (RH2). Він показує співвідношення речовин, які надають і які приймають електрони, а також рівень насичення киснем живильного середовища. Для аеробів і анаеробів умови культивування бактерій дещо відрізняються за цим показником. Анаеробні мікроорганізми найкраще розмножуються при значеннях RH2 не перевищують 5 а аеробні – не менше 10. Уніфікованість. Важливо, щоб живильне середовище містило незмінні кількості окремих її інгредієнтів. Крім того, кращі прозорі розчини, на яких легше відслідковувати ріст культури або помітити її забруднення. Види поживних середовищ
На вибір тієї або іншої середовища для вирощування мікроорганізмів впливає безліч факторів, серед яких - особливості їх живлення і мети дослідження. Основними ознаками, покладеними в основу класифікації поживних середовищ, є:
1. Компоненти. З вихідних речовин, використовуваних для створення субстрату, розрізняють:
натуральні, які готуються з продуктів тваринного або рослинного походження (наприклад, м'яса, молока, фруктів) і зручні для вирощування змішаних культур; напівсинтетичні, в яких дорогі натуральні харчові продукти замінені на нехарчові (наприклад, кісткове борошно, згустки крові), та які оптимальні для культивування бактерій окремих видів або виділення з середовища продуктів їх життєдіяльності; синтетичні, які готуються з точних кількостей хімічних сполук, мають відомий постійний склад і легко відтворюються. 2. Консистенція (густота). Розрізняють середовища:
рідкі; щільні; напіврідкі. Останні дві готують із спеціальних розчинів або рідких речовин з додаванням агар-агару або желатину для створення необхідної щільності. Крім того, щільним середовищем для зростання бактерій є згорнута сироватка крові, картопля, середовища з силікагелем, карагенан.
3. Склад. За цією ознакою середовища бувають:
прості, список яких короткий - це мясопептонний бульйон (МПБ), бульйон і агар Хоттин-гера, мясопептонний агар (МПА), живильний желатин і пептонная вода. складні, що готуються з простих з додаванням крові, сироватки, вуглеводів та інших речовин. 4. Призначення. Виділяють такі поживні середовища:
основні служать для вирощування багатьох патогенних мікробів (зазвичай простого складу); спеціальні застосовують для виділення і культивування бактерій, які не ростуть на простих субстратах; елективні (вони ж виборчі) підходять для виділення конкретного виду бактерій і пригнічують ріст супутніх мікробів (селективність створюється шляхом надбавки до середовищ деяких речовин, наприклад антибіотиків або солей, або корекцією рН); диференціально-діагностичні дають можливість відрізнити один вид бактерій від іншого шляхом оцінки ферментативної активності, наприклад, середовища; консервуючі потрібні для первинного посіву з подальшим транспортуванням зразків, оскільки запобігають відмирання мікроорганізмів, а також пригнічують ріст інших бактерій. Приготування поживних середовищ
Найважливішим етапом культивування анаеробних бактерій є приготування підходящої живильного середовища. Після того, як обрані оптимальні параметри, переходять до наступних стадій:
зважування шляхом відбору навішування компонентів на аналітичних вагах; розчинення, проведене підігрітою до 70 °С дистильованої воді, причому окремо розчиняють фосфати, мікро - і макросоли; кип'ятіння, здійснюване на водяній бані протягом двох хвилин; визначення pH, виконуване індикаторним папером або потенціометром; фільтрація, вироблена через змочений або матерчатий паперовий фільтри для рідких, а також розплавлених щільних середовищ, і через ватно-марлевий фільтр для агаровых; розлив, виконуваний на 3/4 ємності; стерилізація, залежить від складу середовища; контроль на стерильність здійснюється шляхом відстоювання протягом двох діб у термостаті з подальшим переглядом; хімічний контроль для встановлення рН і вмісту необхідних елементів; біологічний контроль шляхом пробного засіву. Стерилізація посуду і середовищ
Одним з основних принципів культивування бактерій є стерильність. Ріст і розвиток сторонніх мікроорганізмів може вплинути на характеристики живильного середовища шляхом зміни її хімічного складу і рН. Стерилізація є головною умовою вирощування чистих культур. На практиці під цим терміном розуміють методи знищення абсолютно всіх життєвих форм на поверхні і в об'ємі стерілізуемих об'єктів. Стерилізації піддається посуд, застосовувані інструменти, середовища, а також інші предмети, що використовуються у ході дослідження.
Деякі види стерилізації:
Прожарювання. Стерилізацію петель і голок для посіву, предметних стекол, деякого інструменту можна виконувати за допомогою пальника або спиртівки. Кип'ятіння. Годиться для обробки шприців, голок, харчових продуктів, але не вбиває спори бактерій. Сухожаровая стерилізація. Проводиться в особливому сушильній шафі і підходить для обробки колб, пробірок і іншої лабораторного посуду. Стерилізація парою. Проводиться в автоклаві цей метод є високоефективним. Але він не годиться для поживних середовищ, до складу яких входять білки або які-небудь інші сполуки, що руйнуються при високих температурах. Більш щадною можна назвати тиндализацию. Вона проводиться в кип'ятильник Коха і поєднує пророщування спор з їх знищенням. Пастеризація. Застосовується для середовищ, що змінюють свої властивості при кип'ятінні (наприклад, молоко, вино, пиво), здатна позбавити їх від неспороносных мікроорганізмів. Температура обробки складає всього 50-60 °С протягом п'ятнадцяти-тридцяти хвилин. В деяких випадках застосовують холодну стерилізацію, здійснювану з допомогою фільтрів або УФ-променів. Умови культивування бактерій
Ріст і розвиток бактерій можливі лише за певних факторах та значення кожного з них: 1. Температура. Розрізняють три групи бактерій, що відрізняються температурними перевагами:
термофилы, або теплолюбні мікроби, ростуть при 45-90°С, а значить, не розмножуються в організмах людини і тварини; психрофилы, або холодолюбиві мікроорганізми, воліють температуру в інтервалі 5-15 °С і вирощуються в холодильних камерах; мезофилы, розвиваються при температурі 25-37 °С, до них відноситься основна маса бактерій. 2. Світло. Є особливістю культивування бактерій-фототрофов, оскільки вони здійснюють фотосинтетичний процес. Але для більшості мікробів освітлення не є обов'язковою умовою. І навіть навпаки, сонячний ультрафіолет може пригнічувати їх розвиток. 3. Вода. Всім мікроорганізмів необхідна вода в доступній (рідкої) формі. Ось чому в заморожених продуктах бактерії практично не розвиваються. 4. Кислотність середовища. Цей принцип культивування бактерій вже був детально розібраний вище. 5. Аерація. Кисень, як хімічний елемент, що є складовою частиною води і чималої кількості сполук, що застосовуються для вирощування мікроорганізмів. Газоподібний кисень також може міститися у воді та інших рідинах в розчиненому вигляді. Істотна частина бактерій потребує постійного надходження молекул кисню. Але ряду мікроорганізмів він без потреби, або, гірше того, газоподібний кисень токсичний для них, оскільки вони не мають каталази і пероксидази, руйнують токсичні продукти дихання. Тому найважливішим етапом культивування анаеробних бактерій є видалення молекул Про 2 з живильного середовища. 6. Культивування мікроорганізмів. Вирощування аеробних і анаеробних бактерій проводиться в різних шарах середовища і в різних режимах.
Вирощування аеробних мікроорганізмів
Для культивування аеробних бактерій потрібно молекулярний кисень. Для одержання чистих культур аеробів, які можна успішно застосовувати в медицині і харчовій промисловості, використовуються наступні методи:
поверхневе вирощування на щільних середовищах або в рідких середовищах (їх тонкому шарі), коли кисень надходить прямо з повітря; глибинне культивування в рідких середовищах, коли підвищення кількості розчиненого в них кисню домагаються шляхом постійної аерації. Вирощування анаеробних мікроорганізмів
Основним принципом культивування бактерій цього типу є мінімальний їх контакт з киснем повітря. Забезпечити умови їх зростання набагато складніше, ніж для аеробів. Для ізоляції анаеробів від молекулярного Про 2 застосовуються наступні методи:
Фізичні. Цей метод культивування анаеробних бактерій зводиться до їх вирощування в спеціальному вакуумному апараті - микроанаэростате. Повітря в ньому замінений на особливу газову суміш азоту з додаванням 10 % водню і 5 % вуглекислого газу. Хімічні. До них відносяться: використання поглинаючих агентів (наприклад, Fe, Na 2 S 2 O 4 , CuCl) або відновлюючих агентів (наприклад, аскорбінова кислота). Біологічні. Зводиться до спільного вирощування аеробів і анаеробів в закритій системі. Цей метод культивування бактерій передбачає засівання однієї половини чашки Петрі якимось з аеробних видів бактерій, а другий - досліджуваним анаэробом. Розвиток його розпочнеться в той момент, коли истратится весь кисень. Для культивування анаеробних бактерій підходять наступні способи посіву:
у поверхневому шарі; у поверхневому шарі з заливкою стерильним парафіном; в товщі щільного живильного середовища; у глибинних шарах в'язких середовищ. Отримання чистої культури
Мікробіологи в своїй роботі зазвичай мають справу із зразками, заселеними безліччю різних видів мікробів. Однак для визначення систематичного положення мікроорганізмів (родина, рід, вид), а також вивчення їх особливостей їх необхідно ізолювати і виростити чисту культуру. Вони мають найважливіше значення в багатьох харчових виробництвах, наприклад, сиру, хліба, квасу, вина і т. д. Культивування молочнокислих бактерій дозволяє отримати найважливіший компонент для виробництва кисломолочних продуктів, тіста, какао, силосу і навіть пластика. Спосіб виділення чистої культури в щільному середовищі заснований на механічному відділенні клітин мікроорганізмів з подальшим їх ізольованим вирощуванням. Зразок переноситься в стерильний обсяг води або фізіологічного розчину (об'ємом 10-100 мл), а потім струшується протягом двох хвилин. Щоб витягти мікроорганізми, що знаходяться в товщі досліджуваного матеріалу (наприклад, ковбаси або сиру), спочатку виконують розтирання шматочків зразка стерильними інструментами з піском. Матеріал, який пройшов попередню підготовку, масою 1 г або об'ємом 1 мл розводять стерильною водою в 101001000 і т. д. разів. Вибирають ту ступінь розведення, яка дає концентрацію клітин, відповідну можливостей методу. Подальше вирощування мікроорганізмів полягає у підготовці живильного середовища. Зазвичай вибирається щільне середовище (МПА). Її попередньо розплавляють і охолоджують до 45-50 °С, а вже потім розливають у кілька чашок Петрі (три-п'ять штук), на дно яких поміщені змиви з різних концентрацій досліджуваної речовини. Далі проводять перемішування ще не застиглою живильного середовища і внесеного до неї матеріалу. Так домагаються фіксування клітин в різних точках об'єму субстрату. Далі чашки Петрі поміщають у термостат на 2 діб при 22 °С. За цей час клітини розмножуються до такої міри, що колонія, утворена кожній з клітин, стає видно неозброєним оком. Кожна з них є чистою культурою того виду бактерій, з клітин якого вона виросла. Після цього з чашок Петрі мікроорганізми пересівають в окремі пробірки, наповнені живильним середовищем. Таким чином проводиться виділення чистих культур із змішаного зразка. Цей метод носить ім'я свого розробника - Р. Коха. Також його прийнято називати чашечным методом, або виснажуючим посівом. Після отримання чистих культур різних видів бактерій виконують встановлення їх форми, виявлення суперечка, сімейства. Всі роботи повинні виконуватись згідно принципів асептики. Щоб уникнути передчасного розвитку мікроорганізмів, дослідження необхідно проводити відразу після відбору проб. Водопровідну воду аналізують після зливу перших порцій, оскільки в них можуть знаходитися накопичилися в трубах і кранах мікроби. Мікрофлора фруктів, ягід і овочів переважно розміщена на поверхні (шкірці), тому виконують змиви з неї. Для цього в стерильну ємність поміщають плід і заливають його необхідною кількістю води. Потім їх досить енергійно струшують і зливають воду в іншу ємність. Посіви з полотняних виробів також отримують змивами, але попередньо з них вирізають шматочки заданого розміру.
