Етапи
Спочатку зразки РНК або ДНК потрібно отримати. Тут молекулярно-генетичний метод може застосовуватися по відношенню до практично будь-якого матеріалу: крапля крові, лейкоцити, культура фибропластов, слизова оболонка (зішкріб), навіть волосяні цибулини, - ДНК можна отримати з будь-якого зразка. Вона придатна для того, щоб застосувати будь-молекулярно-генетичний метод і різні їх варіанти, а вже виділена ДНК довго зберігається в заморожуванні. Другий етап присвячений накопичення потрібних фрагментів (ампліфікації) ДНК, забезпечити його допомагає ланцюгова полімеразна реакція in vitro (у пробірці, без участі живого організму). В результаті вибраний фрагмент ДНК розмножується за допомогою цієї ланцюгової реакції, і кількість ДНК зростає буквально в мільйон разів.Третім етапом молекулярно-генетичних методів дослідження передбачається рестрикція розмножених ДНК (це фрагментованість, розривання або розрізування). Рестрикція проводиться за допомогою електрофорезу на поліакриламідному або агарозному гелі. Цей молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК дозволяє кожному фрагменту зайняти в гелі певне положення. Після цього гель обробляється этидием броміду, здатним зв'язуватися в ДНК, проводиться опромінення ультрафіолетом, після чого можна спостерігати ділянки світіння. Молекулярно-генетичні методи діагностики різноманітні і численні, однак перші два етапи характерні для всіх. А ось для того, щоб виявити фрагменти ДНК, гель можна фарбувати і багатьма іншими існуючими способами.
Різновиди
До самим прямим і поширеним способам виявлення мікобактерій можна віднести вищеописаний молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК. Сутність його полягає в тому, щоб виявити в діагностичному матеріалі специфічні фрагменти ланцюжка ДНК-збудників. Молекулярно-генетичні методи діагностики поки не мають більш ефективного способу розпізнавати таке захворювання, як туберкульоз. Застосовуючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), можна бути впевненим, що вихідна ДНК збільшить кількість копій в мільйон разів, тобто відбудеться ампліфікація, і це дозволить візуалізувати результати. Рівень чутливості тут дуже високий - більше дев'яноста п'яти відсотків, що і є головною перевагою даного методу. Інші молекулярно-генетичні методи дослідження за ефективністю поступаються багаторазового копіювання буквально вдвічі, оскільки в цьому випадку редакційна проба показує специфічну олигонуклеотидную послідовність зросла в сто шість разів. Навіть культуральна діагностика туберкульозу органів дихання значно нижче за своєю чутливості. Саме тому сучасна медицина спирається на молекулярно-генетичні методи діагностики туберкульозу. А описаний метод особливо ефективний при зустрічі з збудниками високою антигенної мінливості, визначити які іншим способом набагато більш складно - потрібні особливі поживні середовища і тривалий час культивування. Біохімічний та молекулярно-генетичний методи дають зовсім різні по ефекту результати.
Діагностика туберкульозу
Вибудовують ПЛР-діагностику туберкульозу найбільш часто з використанням тих послідовностей ДНК, які специфічні для всіх чотирьох видів цього захворювання. Для досягнення поставленої мети найчастіше використовують праймери, що виявляють послідовності IS елементів (IS-986 IS-6110), так як ці мігруючі елементи характеризують суто види мікобактерій туберкульозу і завжди присутні кількома копіями в геномі. Також виділення ДНК можна здійснити з чистих культур і клінічних (мокротиння хворих) будь-яким іншим прийнятним методом. Наприклад, є метод Boom, де використовується лізуючі буфер на основі гуанідину, двоокису кремнію і тиоционата як носія ДНК. Число хворих, що відрізняються мізерним бактеріовиділенням, з кожним роком збільшується, і тому в клінічній практиці утвердився зовсім інший рівень організації: молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК грає головну роль в діагностиці. Однак потрібно визнати, що й він не без недоліків. Застосування ПЛР-методу часто приносить величезна кількість хибнопозитивних результатів, і виною тут не тільки технічні похибки, але і особливості самого методу. Крім усього іншого, за допомогою даного способу діагностики визначити ступінь життєздатності мікобактерій, які виявлені, просто неможливо. Але і цей недолік не найголовніший. Молекулярно-генетичні методи ПЛР-діагностики тягнуть за собою небезпеку контамінації мікобактеріальних ДНК. Сертифікаційні вимоги з цієї причини для ПЛР-лабораторій розроблені виключно жорсткі, вони вимагають наявності трьох ізольованих приміщень. Технологія ПЛР сучасна і дуже складна, її використання вимагає відповідної апаратури й швидко підготовленого персоналу.
Бактеріоскопія
При встановленні діагнозу результати ПЛР-дослідження обов'язково повинні зіставлятися з іншими даними: клінічне обстеження, рентгенографія, мікроскопія мазка, посів і навіть відповідь на специфічне лікування тут дуже важливі. У цьому ряду досліджень ПЛР є тільки одним з компонентів. Виявити збудник в самому початку діагностики можна найбільш простими і швидкими методами - бактеріологічними. Тут використовується світловий мікроскоп (забарвлення по Цилю-Нільсену) та люмінесцентний (забарвлення флюорохромами). Перевагою бактеріоскопії є швидкість отримання результатів. А недоліком її справедливо вважається обмеженість можливостей з-за низької чутливості. Однак саме цього методу віддана рекомендація ВООЗ як найбільш економічного і основного для виявлення хворих на туберкульоз. Виявлення мікобактерій бактеріологічним методом має значення прогнозу, і оцінюється бактеріовиділення кількісно. Набагато впевненіше з цим справляються молекулярно-генетичні методи дослідження туберкульозу.Культуральні дослідження
Кращим виявленням мікобактерій визнають культуральні дослідження. Посів патологічного матеріалу проводиться в яєчні середовища: Мордовського, Фінна II, Левенштейна-Йенсена і тому подібні. Орієнтовним показником розвитку стійкості мікобактерій до препаратів і непрямим свідченням ефективності є кількість мікобактерій чи їх колоній в пробірці, якщо застосовано культуральний метод дослідження. Щоб підвищити відсоток виділення мікобактерій, посів патологічного матеріалу проводиться на кілька середовищ. Задовольняючи численні культуральні потреби, збудника в тому числі надають і рідкі середовища. Використовуються при цьому і автоматизовані системи обліку росту типу ВАНТЕС. Посіви повинні провести в інкубації до семи-восьми тижнів. До цього часу посів з відсутністю зростання можна вважати негативним. Найдієвішим способом виявлення мікобактерій туберкульозу вважають біологічні проби: заражають діагностичним матеріалом морських свинок, які до туберкульозу надзвичайно чутливі.
Трохи цифр
Цікавою областю дослідження, яка відкрилася допомогою ПЛР-діагностики, стало вивчення M. tuberculosis - латентної інфекції. Сучасна концепція туберкульозної інфекції говорить про те, що зі ста чоловік, які перебували в контакті з M. tuberculosis, дев'яносто цілком можуть інфікуватися, але тільки у десяти з них активна хвороба отримує розвиток. Інші мають протитуберкульозний імунітет, і тому в дев'яноста відсотках випадків інфекція залишиться латентною. Виявити таку закономірність допоміг саме молекулярно-генетичний метод. Генетики стверджують, що п'ятдесят п'ять відсотків осіб, у яких посіви патологічного матеріалу були негативними, і вісімдесят відсотків осіб, інфікованих M. tuberculosis, але з протікає без яких-небудь рентгенографічних проявів хворобою, відповіді ПЛР отримали позитивні. Саме генетичний метод діагностики допоміг виявити хворих з груп ризику за допомогою ПЛР-досліджень, причому результати аналізів (мікроскопія і посіви) були негативними, а субклінічна інфекція M. tuberculosis була присутня.
Сучасні дослідження
Бактеріологічні лабораторії Російської Федерації використовують і прискорений метод абсолютних концентрацій: тестується нитратредуктазная активність мікобактерій за допомогою реактиву Грісса. Протитуберкульозні центри користуються методом, який дозволяє визначити лікарську стійкість. Це посів в рідкі середовища, де автоматизована радіометрична і флюоресцентна система обліку росту мікобактерій. Такий аналіз робиться швидко - до двох тижнів. В даний час і нові методи розробляються: лікарська стійкість мікобактерій оцінюється на рівні генотипу. Вивчення молекулярних механізмів резистентності показує наявність генів і у мікобактерій. Ці гени пов'язані з стійкістю до певних препаратів. Наприклад, гени kasA, inhA, katG стійкі до ізоніазиду, ген rpoB - до рифампіцину, гени 16Sp РНК і rpsL - до стрептоміцину, emb1 - до этамбутолу, gyrA - до фторхинолону і так далі.
Мутації
У сучасній діагностиці значно підвищився молекулярно-генетичний рівень методу вивчення ДНК і дозволив проводити широкомасштабні дослідження мутацій у всьому їх спектрі. Тепер ми знаємо, що найбільш поширені мутації в 516526 і 531 кодонах гена rpoB, а також виявлені стійкості до різних препаратів. Існує цілий комплекс методів для типування мікобактерій з використанням не тільки традиційних методів - біохімічних, біологічних та культуральних, але широко застосовуються сучасні молекулярно-генетичні методи. Вже існують адекватні і забезпечують правильну діагностику методики виявлення моногенних хвороб. Вони ґрунтуються на дослідженнях ДНК в точній районі певного гена. Це, як правило, процес складний, трудомісткий і дорогий, зате дані, які надають методи молекулярно-генетичного аналізу, значно більш точні та інформативні, ніж дані всіх інших аналізів. Давно відомо, що ДНК не змінюється за все життя організму, що вона в будь ядерної клітці однакова, і це дає можливість брати на аналіз абсолютно будь-які клітини організму, на будь-яких стадіях онтогенезу. Пошкоджений ген можна виявити до появи перших симптомів, до розгорнутої клініки захворювання, а також у здорових гетерозиготних людей, але мають мутацію в гені. Молекулярно-генетичні методи діагностики спадкових хвороб дозволяють виявити її (прямим підходом ДНК-діагностики), а також проаналізувати сегрегацію захворювання в сім'ї з маркерними локусами ДНК (поліморфними ділянками), які тісно зчеплені з пошкодженим геном (тобто непрямим підходом ДНК-діагностики). Пряма або непряма - будь-яка ДНК-діагностика ґрунтується на методах, що ідентифікують строго певна ділянка ДНК людини.Прямі методи
Прямими методами ДНК-діагностики користуються у випадках, коли ген-винуватець спадкового захворювання відомий, а також відомі і його типи мутацій. Наприклад, доцільні прямі методи при цілому ряді захворювань. Це хорея Гентінгтона (розширення CTG-повторів), фенілкетонурія (R408W), муковісцидоз (delF508 мажорна мутація) і тому подібні. Головною перевагою прямого методу є стовідсоткова точність діагностики, а також немає необхідності робити ДНК-аналіз решти родини. Якщо мутація у відповідному гені виявлена, це дозволяє абсолютно точно затвердити діагноз спадковості, визначити генотип для всієї решти обтяженої сім'ї. Іншою перевагою прямої діагностики вважається виявлення гетерозиготного носійства нехороших мутацій у родичів і батьків померлого від хвороби. Це особливо актуально для захворювань аутосомно-рецесивних. Недоліки прямих методів теж є. Щоб їх застосувати, потрібно точно знати локалізацію патологічного гена, екзон-интронную його структуру і спектр його мутацій. Далеко не всі моногенні хвороби сьогодні отримали таку інформацію. Інформативність прямих методів не може вважатися повною, оскільки один і той же ген може мати велику кількість патологічних мутацій, що і обумовлює розвиток спадкових хвороб.Непрямі методи
Непрямі методи ДНК-діагностики застосовуються зовсім в інших випадках: якщо пошкоджений ген не ідентифікований, а всього лише локалізований на хромосомі, або якщо пряма діагностика не дала результату (це буває, якщо у гена складна молекулярна організація або значна протяжність, якщо в ньому багато патологічних мутацій). Непрямими методами проводиться аналіз сегрегації поліморфних маркерів в сім'ї алелей. Маркери знаходяться в цьому ж хромосомному районі або тісно зчеплені з локусом захворювання і являють собою делеції або інсерції, точкові заміни, повтори, а їх поліморфізм обумовлений різною кількістю в блоці елементів. Найзручнішими для непрямої діагностики вважаються микросателлитние і минисателлитние поліморфні маркери, які широко поширені в геномі людини. Цінність їх виражається у високій інформативності, якщо генетична відстань між ушкодженням в гені і маркером не виявляється занадто великим. В останньому випадку точність оцінки визначається великою мірою частотою рекомбінації між поліморфним маркером і пошкодженням. Непрямі методи діагностики також передбачають обов'язковий попередній етап дослідження частоти алелей аналізованих популяцій серед носіїв мутацій і хворих, плюс до цього необхідність визначення ймовірності нерівноваги і рекомбінації зчеплення маркерів і мутантних алелей гена.