Поняття про ізоелектричної точці
Білки складаються з амінокислот. Деякі з цих сполук (аргінін, аспарагінова кислота, гістидин, глутамінова кислота, лізин) представлені у вигляді радикалів, що містять іоногенні групи, тобто такі групи, які здатні до іонізації. Крім них до іонізації здатні альфа-карбоксильна та аміногрупи, розташовані на вуглецевому і азотному кінцях поліпептидних ланцюгів. Якщо рН розчину дорівнює 7 або наближений до даної позначки, то в іонізованому стані знаходяться всі іоногенні групи. По мірі віддалення від даного значення рН в ту або іншу сторону, причому переважно в кислу, білок починає перехід в изоэлектрическое стан, при якому молекула цієї речовини стає електронейтральної, число іонізованих груп прагне до нуля. Величина рН, при якій білки переходять у изоэлектрическое стан, називається ізоелектричної точки білків (ИЭТ).
Фізико-хімічна природа білків
З-за того, що в склад білків входять карбокси - і амінні групи, вони можуть дисоціювати як підстави і кислоти. Вільна карбоксильна група при дисоціації віддає позитивно заряджений іон водню і аніон COO-. В результаті іон водню приєднується до аміногрупи, що характеризує основні властивості білка, в результаті чого утворюються частинки білка з негативним і позитивним зарядами. При приміщенні білка в кислий розчин його кислотна дисоціація буде придушуватися через значної присутності катіонів водню. І навпаки, при приміщенні його в основний розчин його основна дисоціація буде придушуватися через присутність аніонів COO-.Пропускання через білковий розчин електричного струму призведе до того, що аніони почнуть рухатися до катода, а катіони - до анода. У будь-якому білку є певна величина рН, при якій рух іонів при пропущенні струму не буде відбуватися. У цьому випадку говорять про рівність різноспрямованих іонів і рівність різних ступенів (основний і кислої) в білковій молекулі, що характеризується изоэлектрическим станом. Як відомо, вода являє собою диполь, тому вона має свої частинки навколо білкової молекули в залежності від того, як вона заряджена. У ізоелектричної точці молекула білка не має гидратно-орієнтованої оболонки. Якщо здійснюється осадження білків, необхідно, перш за все, зруйнувати гідратну оболонку, знявши електричний заряд.
Використання ИЭТ в промисловості
У изоэлектрическом стані деякі властивості розчину білка, такі як набухання, в'язкість, осмотичний тиск, світлопропускання, мають мінімальні значення, при цьому показник заломлення і оптична щільність досягають, навпаки, максимальної величини. Изоэлектрическую точку білка можна визначити дослідним шляхом, визначаючи залежність зазначених вище властивостей білкового розчину: від величини рН, при цьому з положення екстремумів на графіках визначають ИЭТ. В изоэлектрическом стані казеїн здатний осідати, що застосовується при виробництві сирів та кисломолочних продуктів, для отримання казеїну із знежиреного молока, як сировини у різних виробництвах (казеїнові клеї, штучні продукти харчування тощо). Вимірювання ИЭТ дозволяє оцінити якість білка, зокрема, молочного продукту на наявність домішок. Це актуально на сьогоднішній день, оскільки введення рослинних добавок в молочну основу дозволяє замінити частину тваринного білка рослинним, який є більш дешевим.Крім цього, ізоелектрична точка білка може використовувати при очищенні стічних вод від птахофабрик. Так, основна частка забруднень стічних вод забійного цеху птахофабрики припадає на білки крові. Враховуючи те, що ИЭТ більшості білків знаходиться в зоні слабокислою реакції середовища, найбільш повне вилучення білків буде відбуватися при слабокислій реакції середовища при величині рН, прагне до ИЭТ.
Фактори, що впливають на ИЭТ
ИЭТ та її визначення
Всі методи визначення ізоелектричної точки білків засновані на приготування буферних розчинів, що мають відмінну реакцію середовища. У всі ці розчини містяться однакові наважки досліджуваного білка, який може бути як в сухому вигляді, так і у вигляді розчину. Використовуються різні методи визначення ИЭТ. Як визначити изоэлектрическую точку білка? Основними методами визначення ИЭТ є електрофорез, по мінімуму в'язкості і пов'язаний із застосуванням водоотнимающих речовин. Можуть використовуватися і інші методи, такі, як визначення ступеня набрякання сухого білка, швидкості застудевания, але вони менш точні і вимагають наявності великої кількості білка.
Електрофорез
При використанні даного методу в прилад для його здійснення поміщаються смужки хромотографической або фільтрувального паперу, змочені певним буферним розчином. Посередині кожної смужки робиться олівцева відмітка, в яку за допомогою піпетки наноситься одна крапля досліджуваного розчину білка. Потім прилад включають і через ці смужки пропускають електричний струм. Макромолекули змінюють свій заряд в залежності від величини рН буферного розчину. Якщо величина рН перевищує ИЭТ, то спостерігається негативний заряд макромолекул, і навпаки.
Застосування інших методів для визначення ИЭТ
При знаходженні в изоэлектрическом стані молекули білків менш гидратировани, тому изоэлектрическую точку білка можна визначити, використовуючи метод по мінімуму в'язкості. Для його застосування необхідно наявність віскозиметра. З допомогою цього приладу визначають відносну в'язкість буферних розчинів. Молекули білка, що знаходиться в изоэлектрическом стані, згорнуті, тому невелика в'язкість буде розчину, в якому його рН буде збігатися з ИЭТ. На цій властивості засновано метод, пов'язаний з дією водоотнимающих коштів. В якості таких засобів можуть виступати ацетон, ефір або спирт. Виділення білків з відповідних розчинів потенційно відбувається тим швидше і повніше, чим повніше відповідає реакція середовища ИЭТ. У ізоелектричної точці розчини білків нестійкі. Таким чином, існують різні методи визначення ізоелектричної точки білка. І її визначення повинно виконуватися в залежності від наявного обладнання, матеріалів, кількості білка.Стійкість білка в ИЭТ
У ізоелектричної точки білка сили відштовхування між білковими частинками в макромолекуле слабшають, завдяки чому відбувається агрегація цих молекул і білок випадає в осад. Це свідчить про те, що в ИЭТ білок нестійкий за рахунок втрати заряду, який є фактором стабілізації водних білкових розчинів. Якщо до білка додати кислоту або підстава, то молекули перезаряджаються, білок здійснює перехід у розчин.