Мікроскопічні методи дослідження являють собою способи вивчення різноманітних об'єктів з використанням спеціального обладнання. Воно дозволяє розглядати будову речовин і організмів, величина яких знаходиться за межами роздільної здатності людського погляду. У статті проведемо короткий аналіз мікроскопічних методів дослідження.

Загальні відомості

Сучасні методи мікроскопічного дослідження використовують в своїй практиці різні фахівці. Серед них вірусологи, цитологи, гематологи, морфології та інші. Основні методи мікроскопічного дослідження відомі досить давно. В першу чергу це світловий спосіб розгляду об'єктів. Протягом останніх років активно запроваджуються в практику й інші технології. Так, популярність придбали фазово-контрастний, люмінесцентний, інтерференційний, поляризаційний, інфрачервоне, ультрафіолетове, стереоскопічний метод дослідження . Всі вони базуються на різноманітних властивості світла. Крім цього, широко використовуються електронно-мікроскопічні методи дослідження . Ці способи дозволяють відобразити об'єкти з допомогою направленого потоку заряджених частинок. Варто зазначити, що такі прийоми вивчення застосовуються не тільки в біології і медицині. Досить популярний мікроскопічний метод дослідження металів і сплавів в промисловості. Таке вивчення дозволяє оцінювати поведінку сполук, виробляти технології для мінімізації ймовірності руйнування і посилення міцності.

Світлові способи: характеристика

Такі мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів та інших об'єктів базуються на різній роздільної здатності устаткування. Важливими факторами при цьому є спрямованість променя, особливості самого об'єкта. Останній, зокрема, може бути прозорим або непрозорим. У відповідності з властивостями об'єкта, змінюються фізичні властивості світлового потоку – яскравість і колір, обумовлені амплітудою і довжиною хвилі, площина, фаза і спрямованість поширення хвилі. На використанні цих характеристик і будуються різні мікроскопічні методи дослідження .

Специфіка

Для вивчення світловими способами об'єкти, як правило, фарбують. Це дозволяє виявити і описати ті або інші їх властивості. При цьому необхідно, щоб тканини були фіксованими, оскільки забарвлення виявить певні структури виключно в убитих клітинах. У живих елементах барвник обосабливается у вигляді вакуолі в цитоплазмі. Вона не фарбує структури. Але з допомогою світлового мікроскопа можна досліджувати і живі об'єкти. Для цього використовується вітальний спосіб вивчення. У таких випадках застосовується темнопольний конденсор. Він вбудовується в світловий мікроскоп.

Вивчення нефарбованих об'єктів

Воно здійснюється з допомогою фазово-контрастної мікроскопії. Цей спосіб базується на дифракції світла у відповідності з особливостями об'єкта. У процесі впливу відзначається зміна фази і довжини хвилі. В об'єктиві мікроскопа присутній напівпрозора пластинка. Живі або фіксовані, але не забарвлені об'єкти з-за своєї прозорості майже не змінюють колір і амплітуду променя, що проходить крізь них, провокуючи тільки зсув фази хвильової. Але при цьому, пройшовши через об'єкт, світловий потік відхиляється від пластинки. В результаті між променями, пропущеними крізь об'єкт, і входять у світловий фон, з'являється різниця хвильовий довжини. При певному її значенні виникає візуальний ефект – темний об'єкт буде чітко видно на світлому фоні або навпаки (у відповідності з особливостями фазової пластинки). Для його отримання різниця повинна становити не менше 1/4 довжини хвилі.

Аноптральний спосіб

Він є різновидом фазово-контрастного методу. Аноптральний спосіб передбачає використання об'єктива зі спеціальними пластинами, які змінюють тільки колір і яскравість фонового світла. Це істотно розширює можливості вивчення незабарвлених живих об'єктів. Застосовується фазово-контрастний мікроскопічний метод дослідження в мікробіології , паразитології при вивченні рослинних і тваринних клітин, найпростіших організмів. У гематології цей спосіб використовується для розрахунку і визначення диференціювання елементів крові і кісткового мозку.

Інтерференційні прийоми

Ці мікроскопічні методи дослідження вирішують в цілому ті ж завдання, що і фазово-контрастні. Однак в останньому випадку фахівці можуть спостерігати тільки контури об'єктів. Інтерференційні мікроскопічні методи дослідження дозволяють вивчати їх частини, виконувати кількісну оцінку елементів. Це можливо завдяки роздвоєння світлового променя. Один потік проходить крізь частку об'єкта, а інший – мимо. В окулярі мікроскопа вони сходяться і інтерферують. Виникає різниця фаз може визначатися по масі різних клітинних структур. При послідовному її вимірі з заданими показниками заломлення можна встановити товщину нефіксованих тканин і живих об'єктів, вміст білків у них, концентрацію сухої речовини і води та ін. У відповідності з отриманими даними фахівці отримують можливість опосередковано оцінювати проникність мембран, активність ферментів, клітинний метаболізм.

Поляризація

Вона здійснюється з допомогою призм Ніколя чи плівчастих поляроїдів. Їх поміщають між препаратом і джерелом світла. Поляризаційний мікроскопічний метод дослідження в мікробіології дозволяє вивчати об'єкти з неоднорідними властивостями. В ізотропних структурах швидкість поширення світла не залежить від обраної площини. При цьому в анізотропних системах швидкість змінюється відповідно до спрямованістю світла з поперечною або поздовжньою осі об'єкта. У разі якщо величина заломлення уздовж структури буде більше, ніж уздовж поперечної, створюється подвійне позитивне лучепреломление. Це властиво багатьом біологічним об'єктам, у яких виявляється сувора молекулярна орієнтація. Вони всі є анізотропними. До цієї категорії, зокрема, належать міофібрили, нейрофибрилли, вії у мерцательном епітелії, колагенові волокна та інші.

Значення поляризації

Порівняння характеру променевого показника заломлення і анізотропії об'єкта дає можливість оцінювати молекулярну організацію структури. Поляризаційний метод виступає як один з гістологічних методів аналізу, що використовується в цитології та ін. У світлі можна вивчати не лише забарвлені об'єкти. Поляризаційний метод дає можливість дослідити незабарвлені і нефіксовані – нативні препарати тканинних зрізів.

Люмінесцентні прийоми

Вони базуються на властивостях деяких об'єктів давати світіння в синьо-фіолетовій ділянці спектра або в УФ-променях. Багато речовин, наприклад білки, деякі вітаміни, коферменти, лікарські засоби, наділені первинної (власної) люмінесценцією. Інші об'єкти починають світитися при додаванні флюорохромов – спеціальних барвників. Ці добавки вибірково або дифузно поширюються на окремі клітинні структури або хімічні сполуки. Це властивість лягло в основу використання люмінесцентної мікроскопії при гістохімічних та цитологічних дослідженнях.

Області використання

Застосовуючи імуно-флуоресценцію, фахівці виявляють вірусні антигени і встановлюють їх концентрацію, ідентифікують віруси, анти тіла і антигени, гормони, різноманітні продукти метаболізму і так далі. У цьому зв'язку при діагностиці герпесу, епідемічного паротиту, вірусного гепатиту, грипу та інших інфекцій використовуються люмінесцентні методи дослідження матеріалів. Мікроскопічний імуно-флуоресцентний спосіб дозволяє розпізнавати пухлини злоякісного характеру, визначати ішемічні ділянки в серці на ранніх етапах інфаркту та ін.

Використання ультрафіолету

Воно ґрунтується на здатності деяких речовин, включених в живі клітини, мікроорганізми або фіксовані, але незабарвлені, прозорі при видимому світлі тканини поглинати УФ-промені певної довжини хвиль. Це характерно, зокрема, для високомолекулярних сполук. До них відносять білки, ароматичні кислоти (метилаланин, триптофан, тирозин тощо), нуклеїнові кислоти, пирамидиновие і пуринові підстави і так далі. Ультрафіолетова мікроскопія дозволяє уточнити локалізацію і кількість цих сполук. При вивченні живих об'єктів спеціалісти можуть спостерігати зміни процесів їх життєдіяльності.

Додатково

Інфрачервона мікроскопія використовується при дослідженні непрозорих для світла і УФ-променів об'єктів допомогою поглинання їх структурами потоку, довжина хвилі якого 750-1200 нм. Щоб застосувати цей спосіб немає необхідності попередньо піддавати препарати хімічної обробці. Як правило, інфрачервоний метод використовується в антропології, зоології та інших біологічних галузях. Що стосується медицини, то цей спосіб застосовують переважно в офтальмології та нейроморфологии. Вивчення об'ємних об'єктів здійснюється з допомогою стереоскопічної мікроскопії. Конструкція обладнання дозволяє виконувати спостереження лівим і правим оком під різним кутом. Непрозорі об'єкти досліджуються при порівняно невеликому збільшенні (не більше 120 разів). Стереоскопічні способи використовуються в хірургії, патоморфології, судової медицини.

Електронна мікроскопія

Вона використовується для вивчення структури клітин і тканин на макромолекулярному і субклітинному рівнях. Електронна мікроскопія дозволила зробити якісний стрибок у сфері досліджень. Цей спосіб широко застосовується в біохімії, онкології, вірусології, морфології, імунології, генетики та інших галузях. Значне посилення роздільної здатності устаткування забезпечується потоком електронів, які проходять у вакуумі крізь електромагнітні поля. Останні, у свою чергу, створюються спеціальними лінзами. Електрони мають здатність проходити крізь структури об'єкта або відбиватися від них з відхиленнями під різними кутами. В результаті створюється відображення на люмінесцентному екрані приладу. При просвічує мікроскопії виходить площинне зображення, при скануючої, відповідно, об'ємне.

Необхідні умови

Варто відзначити, що перед тим, як пройти електронне мікроскопічне дослідження, об'єкт піддається спеціальній підготовці. Зокрема, використовується фізична або хімічна фіксація тканин і організмів. Секційний і біопсійний матеріал, крім цього, зневоднюють, впроваджують в епоксидні смоли, розрізають алмазними або скляними ножами на ультратонкі зрізи. Потім їх контрастують і вивчають. У скануючому мікроскопі досліджуються поверхні об'єктів. Для цього на них напилюють спеціальні речовини у вакуумній камері.