Історична довідка
У 1852 р. британський вчений Стокса вперше описав флуоресценцію. Він ввів новий термін в результаті виконаних експериментів з плавиковим шпатом, який випускав червоне світло під впливом ультрафіолету. Стокс зазначив цікаве явище. Він виявив, що довжина хвилі при флуоресцентному випромінюванні завжди більше, ніж у потоку світла збудження.Для підтвердження гіпотези в 19-му столітті було проведено безліч експериментів. Вони показали, що різноманітні зразки флуоресціюють під дією ультрафіолету. Серед матеріалів, у числі іншого, були кристали, смоли, мінерали, хлорофіл, лікарську сировину, неорганічні сполуки, вітаміни, олії. Безпосереднє ж застосування барвників для проведення біологічних аналізів почалося тільки в 1930 р.
Флуоресцентна мікроскопія: опис
Деякі з матеріалів, використаних у дослідженнях першої половини 20-го століття, володіли високою специфічністю. Завдяки показникам, які не могли бути досягнуті контрастними способами, метод флуоресцентної мікроскопії став найважливішим інструментом і в біомедичних, і в біологічних дослідженнях. Важливе значення отримані результати мали і для матеріалознавства.Які переваги має метод флуоресцентної мікроскопії ? За допомогою нових матеріалів стало можливим виділення високоспецифічних клітин і субмікроскопічних компонентів. Флуоресцентний мікроскоп дозволяє виявити окремі молекули. Різноманітні барвники дозволяють ідентифікувати кілька елементів одночасно. Незважаючи на обмеженість просторового дозволу обладнання дифракційною межею, який, у свою чергу, залежить від специфічних властивостей зразка, виявлення молекул нижче цього рівня також цілком можливо. Різні зразки після опромінення виявляють автофлуоресценцию. Це явище досить широко застосовується в петрології, ботаніки, напівпровідникової промисловості.
Особливості
Вивчення тканин тварин або патогенних мікроорганізмів часто ускладнюється або надто слабкою, або дуже сильною неспецифічного автофлуоресценцией. Однак значення в дослідженнях набуває внесення в матеріал компонентів, порушуваних на певній довжині хвилі і випускають світловий потік необхідної інтенсивності. Флуорохроми виступають в якості барвників, здатних самостійно прикріплятися до структур (невидимим або видимим). При цьому вони відрізняються високою вибірковістю щодо мішеней та квантовим виходом. Флуоресцентна мікроскопія стала широко застосовуватися з появою природних та синтетичних барвників. Вони володіли певними профілями інтенсивності флуоресценції та збудження і були націлені на конкретні біологічні мішені.
Виявлення окремих молекул
Часто в ідеальних умовах можна зареєструвати світіння окремого елемента. Для цього, крім іншого, потрібно забезпечити досить низький шум детектора і оптичний фон. Молекула флуоресцеїну до руйнування внаслідок фотообесцвечивания може випускати до 300 тис. фотонів. При 20 % збору та ефективності процесу їх можна зареєструвати в кількості близько 60 тис. Флуоресцентна мікроскопія , заснована на лавинних фотодиодах або електронному множенні, давала змогу дослідникам спостерігати поведінку окремих молекул протягом секунд, а в ряді випадків і хвилин.Складності
Ключовою проблемою виступає придушення шуму від оптичного фону. У зв'язку з тим, що багато з матеріалів, використовуваних у конструкції фільтрів та лінз, виявляють деяку автофлуоресценцию, зусилля вчених на початкових етапах були орієнтовані на випуск компонентів, що володіють малою флуоресценцією. Проте подальші експерименти привели до нових висновків. Зокрема, було встановлено, що флуоресцентна мікроскопія , заснована на повному внутрішньому відбитті, дозволяє досягти низького фону і високоінтенсивного збудливого світлового потоку.
Механізм
Принципи флуоресцентної мікроскопії , заснованої на повному внутрішньому відбитті, полягають у використанні бистрозатухающей або нераспространяющейся хвилі. Вона виникає на межі середовищ з різними показниками заломлення. В даному випадку світловий пучок проходить крізь призму. Вона володіє високим параметром заломлення. Призма прилягає до водного розчину або скла з низьким параметром. Якщо потік світла направляється на неї під кутом, що більше критичного, пучок повністю відбивається від межі поділу. Це явище, у свою чергу, викликає нераспространяющуюся хвилю. Іншими словами, створюється електромагнітне поле, що проникають у середовище з меншим параметром заломлення на відстань менше 200 нанометрів. У нераспространяющейся хвилі інтенсивність світла буде цілком достатньою для збудження флуорофорів. Однак внаслідок її виключно незначної глибини його обсяг буде дуже малим. В результаті виникає низькорівневий фон.